Разработка биомедицинского препарата гемопоэтических стволовых клеток для персонифицированной протеом- основанной терапии опухолей головного мозга

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27.06.2014 года № 14.575.21.0038 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы» на этапе №1 в период с 27.06.2014 по 31.12.2014 выполнялись следующие работы:

1 Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной и методической литературы.

2 Обоснование направления исследований и способы решения поставленных задач.

3 Проведение сравнительной оценки вариантов возможных решений исследуемой проблемы с учетом результатов прогнозных исследований, проводившихся по разработке способов лечения злокачественных опухолей центральной нервной системы (ЦНС).

4 Разработка экспериментальной модели неопластического процесса посредством имплантации опухолевых клеток в головной мозг экспериментальных животных.

5 Разработка лабораторных технологий изучения процессов противооопухолевого взаимодействия клеток in vitro.

6 Разработка лабораторных технологий изучения процессов направленной миграции гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) к опухоли в мозге экспериментальных животных in vivo.

7 Проведение патентных исследований.

8 Разработка методов сравнительного протеомного картирования и профилирования нейральной стволовой клетки, мультипотентной мезенхимальной стромальной и опухолевой стволовой клетки глиобластомы человека.

9 Выполнение серии экспериментов сравнительного протеомного картирования и профилирования лизатов.

При этом были получены следующие результаты

1. Краткое описание основных результатов:

Выполнен аналитический обзор литературы, обоснованы направления исследований и способы решения поставленных задач, проведена сравнительная оценка вариантов возможных решений исследуемой проблемы с учетом результатов прогнозных исследований, проводившихся по разработке способов лечения злокачественных опухолей центральной нервной системы. Результат представлены в виде статьи в международном научно-аналитическом журнале «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» 2014 г., Том 158, № 12., C.762 - 769.

Имплантация 2×10⁵– 2 ×10⁶ клеток (фенотипа CD 133⁺ не менее 45%) глиомы С6 в мозг крыс линии позволяет получить стандартную и воспроизводимую модель МГБ человека. Магнитно-резонансная томография выявляет неопластический узел окруженный зоной перифокального отека и участками кровоизлияний. Опухоль характеризуется инвазивным ростом, ангиогенезом, атипией и ангиоцентрической группировкой опухолевых клеток (ОК), общей и местной реакцией микро и макроглии,  быстрым формированиев очагов некроза. Средняя продолжительность жизни животных составляет 37,23± 4,22дня с момента операции, за 30 дней наблюдений опухоль в тиридцать раз увеличивает свой объем. Разработанная модель наиболее полно соответствует мультиформной глиобластоме человека (п.4 ПГ).

Разработана лабораторная технология изучения процессов противоопухолевого взаимодействия между  гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК) и ОК in vitro. Установлено, что протеомный обмен между ГСК и ОК тормозит репликацию ОК и отодвигает фазу логарифмического роста. Стратегически важным условием противоопухолевого действия ГСК является их численное преимущество над ОК (п.5 ПГ).

Разработаны лабораторные  технологии изучения процессов направленной миграции ГСК в опухолевый очаг в мозге крыс in vivo. Установлено, что ГСК мигрируют в опухоль проникая в кровеносные сосуды. ГСК введенные в мозг животного с глиомой С6 скапливаются в желудочках мозга, в непосредственной близости от герминативных зон, проникают кровеносное русло достигают пораженной гемисферы, где распределяются вдоль границ с опухолью. ГСК введенные в системный кровоток быстро достигают опухоли и распределяются в ней взаимодействуя с ОК (п. 6 ПГ).

Патентные исследования выполнены в полном соответствии с регламентом. Проанализировано 196 источников научной информации и 322 научные публикации. Показано, что разработки биомедицинских клеточных препаратов для лечения опухолей  мозга, в частности на основе ГСК, активно ведутся в 13 странах мира, особой активностью по патентованию технических решений в исследуемой области отличаются США и Россия. Однако вклад в разработку данного направления отечественных заявителей незначителен, несмотря на актуальность и перспективность исследуемого направления, которые подтверждаются как динамикой патентования охраноспособных технических решений по годам, так и ростом научных публикаций. Исследуемая тематика является охраноспосособной, имеет в РФ хорошую перспективу и будет активно развиваться в ближайшие годы (п.7 ПГ).

Разработаны методы и проведено протеомное картирование, инвентаризация, профилирование и  предварительный биоинформационный анализ лизатов белков нейральных (CD 133+) стволовых клеток (НСК), выделенных из обонятельной выстилки носа человека, мультипотентных мехенхимальных (CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, СD34–) стромальных клеток (ММСК), полученных из костного мозга человека и опухолевых (CD133+) стволовых клеток (ОСК) глиобластомы человека линии U87.  Идентифицированы 1664 белка в изученных лизатах стволовых клеток (СК), из  которых 1052 белка (63,2%) идентичны в НСК и ОСК   и  607 белков (36,47%)  подобны  в ММСК и ОСК. Остальные белки в ОСК глиобластомы U87 являются онкоспецифичными или связанны с процессами канцерогенеза. Для белков, присутствующих во всех трех протеомах, с помощью международных баз данных проведено аннотирование биологических процессов, молекулярных функций, клеточной локализации и сигнальных путей белков. Выявили, что в глиомасферах глиобластомы линии U87 только 10  внутриклеточных путей сигнальной трансдукции (ВКПСТ) практически не изменены неопластическим процессом, но  только 2  из них (путь интегринов  и путь фокальной адгезии) доступны  для регуляторного воздействия на  гены-кандидаты в ядре ОСК. Мембранные белки, неизменных канцерогенезом ВКПСТ и гены экспрессирующие белки этих путей в ОСК глиобластомы линии U87 могут рассматриваться в качестве основных целей и мишеней  для таргетного воздействия на ОСК (п.8 - 9 ПГ).

2. Оценка элементов новизны научных, конструкторских и технологических решений, информация о полученных за отчетный период охраноспособных РИД

Впервые, на собственном экспериментальном материале показано, что содержание ОК клеток  CD 133⁺ фенотипа в культуре имплантируемых ОК является более важным параметром, при моделировании опухолей, чем общее число вводимых ОК. Впервые, с использованием методов лазерной мультифотонной микроскопии, методов автоматизированного культивирования и мониторинга количества ОК in vitro показан основной механизм противоопухолевого действия ГСК и продемонстрированы их противоопухолевые свойства in vitro. Указанная технология может быть использована при проведении доклинической оценки эффективности противоопухолевых клеточных препаратов (патентная заявка от 05.12.2014 вход. № 079164, регистрационный № 2014149234). Кроме того, получено положительное решение о выдаче патента по ранее поданной патентной заявке (№ 2012156017/10(088629) от 23.09.2014). Впервые изучены особенности миграции ГСК в организме животного с опухолью. Впервые в мировой практике созданы протеомные карты здоровых НСК, и ММСК человека и ОСК глиобластомы человека линии U87. Впервые в мировой практике создана матрица подобия здоровых стволовых и опухолевых клеток. Идентифицировано 2  пути внутриклеточной сигнальной трансдукции доступные для регуляторного воздействия на  гены-кандидаты в ядре ОСК. По результатам работ опубликовано 2 статьи в журналах Web of Science (Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Cell transplantation (IF4,44)), 1 статья направленна в журнал входящий Web of Science (принято к публикации Oncology letters), две стати направленны в Российский биотерапевтический журнал.

3. Оценка соответствия полученных результатов техническим требованиям к выполненному проекту и перспектив продолжения работ по проекту

Полученные результаты соответствуют техническим требованиям, предъявляемым к результатам проекта. Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27.06.2014 года № 14.575.21.0038 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы» на этапе №2 в период с 01.01.2015 по 31.06.2015 выполнялись следующие работы:

1. Разработка лабораторной технологии изучения процессов и изучение процессов направленной миграции клеток in vitro в отношении глиомы линии С6
2. Проведение экспериментов по совместному культивированию  опухолевых клеток и гемопоэтических стволовых клеток в условиях пространственного разделения культур
3. Разработка методов маркирования гемопоэтических стволовых клеток и опухолевых клеток флуорохромным красителем
4. Изучение in vitro особенностей и механизмов взаимодействия гемопоэтических стволовых клеток с неопластическими клетками первичных и метастатических опухолей мозга человека
5. Изучение процессов направленной миграции гемопоэтических стволовых клеток к опухоли в мозге экспериментальных животных in vivo.
6. Изучение in vivo особенностей течения неопластического процесса в мозге экспериментальных животных под воздействием аутологических ГСК и установления характера их дальнейшего существования.
7. Изучение роли трасформирующего фактора роста β в онкогенезе мультиформной глиобластомы.
8. Разработка метода изучения биоинформационной роли стволовых клеток в неопластическом очаге.
9.  Разработка методов изучения и изучение возможности управления ключевыми (эффекторными) функциями опухолевых клеток при взаимодействии с индуцированными в направлении апоптоза гемопоэтическими стволовыми клетками в серии экспериментов in vitro и in vivo.
10. Материально – техническое обеспечение проекта

При этом были получены следующие результаты

1. Краткое описание основных результатов:

Установлено, что источником цитокинов регулирующих процессы направленной миграции стволовых клеток могут быть непосредственно опухолевые клетки. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) направленно мигрируют в опухоль и способны воздействовать на опухолевые клетки инфильтрирующие паренхиму мозга.  Адгезия ГСК  к поверхности неопластических клеток является необходимым условием противоопухолевого межклеточного взаимодействия и логическим смыслом направленной миграции.

Разработана методика маркирования ГСК и опухолевых клеток флуорохромным красителем.

Установлены механизмы взаимодействия ГСК с клетками рака лёгких и молочной железы: секреция регуляторных белков, запускающих в раковых клетках апоптоз по митохондриальному пути. Установлен механизм противоопухолевого действия ГСК в отношении клеток глиобластомы: активизация рецепторных белков клеточной поверхности. Установлены мишени для воздействия ГСК на опухолевые стволовые клетки глиобластомы U87: сигнальные пути интегринов и фокальной адгезии.

Впервые получена и апробирована модель эпителиально-мезенхимального перехода для линии клеток U87 глиобластомы человека. Впервые, разработана масс-спектрометрическая методология  картирования протеома  линий опухолевых клеток U87. Получены протеомные карты с указанными на них статистически значимыми изменениями в уровнях экспрессии белков после обработки клеток TGF-β. Впервые изучены молекулярные механизмы действия TGF-β на активацию эпителиально-мезенхимального перехода в клетках глиобластомы человека. Выявлены внутриклеточные сигнальные пути, ответственные за участие TGF-β в онкогенезе злокачественных глиом и установлены важные закономерности. Впервые обнаружены кандидатные маркеры метастазирования глиобластомы и потенциальные  мишени для терапии этого заболевания.

Изучены процессы миграции ГСК in vivo: доказано, что 74,52% введённых ГСК направленно мигрируют в полушарие мозга с опухолью.  Разработаны методы изучения биоинформационной роли ГСК в неопластическом очаге in vivo и in vitro: доказано, что ГСК с индуцированным апоптозом достоверно подавляют рост глиомы С6 и вызывают их гибель путём апоптоза по митохондриальному сигнальному пути.

По результатам работ опубликована одна статья в научном журнале, индексируемом в базе данных Web of Science. Две кандидатские диссертации сданы в Диссертационные советы. Состав выполненных работ удовлетворяет условиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Техническому заданию и Плану-графику исполнения обязательств. Результаты выполненных работ соответствует требованиям Технического задания и нормативной документации.

2. Оценка элементов новизны научных, конструкторских и технологических решений, информация о полученных за отчетный период охраноспособных РИД

Впервые установленно, что источником цитокинов регулирующих процессы направленной миграции стволовых клеток могут быть непосредственно опухолевые клетки. Данный факт позволяет рассматривать феномен направленной миграции как важный регуляторно- саногенетический механизм. Нарушения в работе которого являются необходимым условием для запуска процессов канцерогенеза.

Впервые установлены механизмы взаимодействия ГСК с клетками рака лёгких и молочной железы: секреция регуляторных белков, запускающих в раковых клетках апоптоз по митохондриальному пути. Установлен механизм противоопухолевого действия ГСК в отношении клеток глиобластомы: активизация рецепторных белков клеточной поверхности. Установлены мишени для воздействия ГСК на опухолевые стволовые клетки глиобластомы U87: сигнальные пути интегринов и фокальной адгезии.

Впервые в мировой экспериментальной медицине получена и апробирована модель эпителиально-мезенхимального перехода для линии клеток U87 глиобластомы человека. Впервые, разработана масс-спектрометрическая методология  картирования протеома  линий опухолевых клеток U87. Впервые, получены протеомные карты с указанными на них статистически значимыми изменениями в уровнях экспрессии белков после обработки клеток TGF-β. Изучены молекулярные механизмы действия TGF-β на активацию эпителиально-мезенхимального перехода в клетках глиобластомы человека. Выявлены внутриклеточные сигнальные пути, ответственные за участие TGF-β в онкогенезе злокачественных глиом и установлены важные закономерности. Обнаружены кандидатные маркеры метастазирования глиабластомы и потенциальные  мишени для терапии этого заболевания.  Впервые, с позиций постгеномных технологий обоснована роль трансформирующего фактора роста β в онкогенезе мультиформной глиобластомы.

Впервые доказано, что 74,52% ГСК направленно мигрируют в полушарие мозга с опухолью.  Доказано, что ГСК с индуцированным апоптозом достоверно подавляют рост глиомы С6 и вызывают их гибель путём апоптоза по митохондриальному сигнальному пути. Впервые, предложены методы оценки in vivo противоопухолевой эффективности биомедицинских препаратов на основе стволовых клеток с ремоделированным транскриптомом.

3. Оценка соответствия полученных результатов техническим требованиям к выполненному проекту и перспектив продолжения работ по проекту

Полученные результаты соответствуют техническим требованиям, предъявляемым к результатам проекта. Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Результаты протеомного картирования клеток линии U87 глиобластомы человека до и после воздействия трансформирующим фактором роста 1 бетта (Supplement 1, Supplement 2)

Results proteomic mapping of U87 glioblastoma cell line human before and after exposure to transforming growth factor beta 1 (Supplement 1, Supplement 2)

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27.06.2014 года № 14.575.21.0038 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы» на этапе №3 в период с 01.07.2015 по 31.12.2015 выполнялись следующие работы:

1. Проведения аннотирования биологических процессов, молекулярных функций, клеточной локализации и сигнальных путей для белков присутствующих в протеомах нейральной и мезенхимальной стволовых клетках человека и опухолевой стволовой клетке глиобластомы человека;
2. Разработка методов сравнительного протеомного картирования и профилирования и проведение протеомного картирования и профилирования МСК и ОСК аденокарциномы молочной железы и легких человека;
3. Исследования in vitro противоопухолевого действия препарата ГСК с ремоделированным протеомов в отношении первичных и метастатических опухолей головного мозга человека;
4. Исследование возможности и изучение специфических механизмов противоопухолевого действия препарата ГСК in vivo на моделях животных с первичными и метастатическими опухолями головного мозга;
5. Проведение работ in vivo по изучению возможностей использования биомедицинского клеточного препарата для лечения метастатических опухолей на модели аденокарциномы легкого у крыс и аденокарциномы молочной железы у мышей:
6. Материально- техническое обеспечение ПНИ

Проведено  аннотирование  биологических процессов, молекулярных функций, клеточной локализации и сигнальных путей для белков присутствующих в протеомах лизатов глиомасфер опухолевых стволовых (СD 133+) клеток линии U87 глиобластомы человека, нейральных (СD 133+) стволовых клеток и мезенхимальных (CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, СD34–) стволовых клеток человека. Идентифицировано 1664 белка (протеомная карта прилагается) в изученных лизатах стволовых клеток, из  которых 1052 белка (63,2%) идентичны в НСК и ОСК   и  607 белков (36,47%)  подобны  в МСК и ОСК. Остальные белки в ОСК линии U87 глиобластомы представляют собой видоспецифичную неопластическую протеомную структуру и связанны с процессами канцерогенеза. Проведен поиск  мембранных белков – мишеней связанных с внутриклеточными путями сигнальной трансдукции в ОСК не пострадавших в процессе канцерогенеза. Установлено,  НСК и МСК способны секретировать лиганды воздействующие на сигнальные пути имеющие домен в ядре ОСК. В глиомасферах глиобластомы линии U87 идентифицированно только 2  сигнальных пути (путь интегринов  и путь фокальной адгезии) доступных  для регуляторного воздействия на  гены-кандидаты в ядре ОСК.

Разработаны методы сравнительного протеомного картирования и профилирования и проведено протеомное картирование и профилирования ОСК аденокарциномы молочной железы и легких человека. Созданы протеомные карты клеток линии МСА-7 рака молочной железы и А-549 рака легкого человека.

Доказано, что ГСК с индуцированным апоптозом достоверно подавляют рост глиомы С6 и вызывают их гибель путём апоптоза. Впервые, предложены методы оценки in vivo противоопухолевой эффективности биомедицинских препаратов на основе стволовых клеток. Впервые установлены механизмы взаимодействия ГСК с клетками рака лёгких и молочной железы: секреция регуляторных белков, запускающих в раковых клетках апоптоз. Установлен механизм противоопухолевого действия ГСК в отношении клеток глиобластомы: активизация рецепторных белков клеточной поверхности.

Исследованы возможности и изучены специфические механизмы противоопухолевого действия препарата ГСК in vivo на моделях животных с первичными и метастатическими опухолями головного мозга; изучены ключевые закономерности взаимодействия гемопоэтических стволовых клеток с клетками глиальных опухолей in vivo. Установлено, что  ГСК адгезируют к поверхности клеток глиальных опухолей и  взаимодействуют с ними. В ходе межклеточной коммуникации  наблюдается феномен переноса цитоплазматического содержимого  из ГСК в опухолевые клетки. В этот процесс вовлечено 31,78±7,5% клеток линии С6 и только 17,4±7,9% культуры сепарированных опухолевых стволовых клеток иммунофенотипа CD 133+ линии U87 глиобластомы. Данный феномен сопровождается замедлением темпов пролиферации опухолевых клеток, при этом выраженность цитостатического эффекта возрастает при увеличении числа ГСК. Обработка гемопоэтических (CD34+) стволовых клеток в растворе 0,005 мкмоль/л фаскаплизина позволяет получить культуру стволовых клеток с индуцированным апоптозом. При совместном культивировании  с клетками  глиомы С6, предобработанные в растворе фаскаплизина ГСК адгезируют к опухолевым клеткам, и взаимодействуют с ними. Запуск апоптоза в ГСК способствует уничтожению  68,4±12,4% популяции клеток глиомы С6.

Проведены работы in vivo по изучению возможностей использования биомедицинского клеточного препарата для лечения метастатических опухолей на модели аденокарциномы легкого у крыс и аденокарциномы молочной железы у мышей. Две статьи опубликовано в журналах входящих в базы Scopus и Web of Science, две статьи приняты к публикации.  Защищена одна кандидатская  диссертация и еще одна передана  в Диссертационный Совет.

2. Научная новизна полученных результатов

Впервые, на собственном экспериментальном материале установлены фундаментальные закономерности феномена миграции стволовых в опухолевый очаг. Доказанно, что нейральные и гемопоэтические стволовые клетки обладают лучшей подвижностью в отношении опухолевых стволовых клеток МГБ.  Установлено in vivo, что стволовые клетки направленно мигрируют в опухоль и накапливаются в участках инвазивного роста и зонах некроза опухолевой ткани, вектор миграционной активности более выражен между клеткам, имеющими единый гистогенетический источник. При отсутствии опухоли, НСК мигрируют в герминативные зоны мозга, а  ГСК  не имеют единой цели миграции в организме интактных животных.

Впервые в мировой практике проведено протеомное картирование и профилирование белков лизатов глиомасфер опухолевых стволовых (СD 133+) клеток линии U87 глиобластомы человека, нейральных (СD 133+) стволовых клеток и мезенхимальных (CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, СD34–) стволовых клеток человека. Идентифицировано 1664 белка в изученных лизатах стволовых клеток, из  которых 1052 белка (63,2%) идентичны в НСК и ОСК   и  607 белков (36,47%)  подобны  в МСК и ОСК. Остальные белки в ОСК линии U87 глиобластомы представляют собой видоспецифичную неопластическую протемноую структуру и связаннуы с процессами канцерогенеза. Проведен поиск  мембранных белков – мишеней связанных с внутриклеточными путями сигнальной трансдукции в ОСК не пострадавших в процессе канцерогенеза. Диагностированно 22 пути сигнальных пути применимые для регуляции функций ОСК, которые могут рассматриваться в качестве мишеней  для таргетного воздействия. Установлено,  НСК и МСК способны секретировать лиганды воздействующие на 9 сигнальных путей имеющих домен в ядре ОСК: пути активации Т и В клеток, пути воспаления опосредованного хемокинами и цитокинами, пути гликолиза, пути ангиогенеза, пути VEGF, FGF и IGF. Интегриновый сигнальный путь наиболее пригоден для целенаправленного регуляторного воздействия на эффекторные функции ОСК.

Доказано, что ГСК  при со-культивировании in vitro адгезируют к поверхности опухолевых клеток. В процессе взаимодействия наблюдается переноса цитоплазматического содержимого из ГСК в опухолевые клетки, что сопровождается замедлением темпов пролиферации опухолевых клеток, выраженность цитостатического эффекта возрастает по мере увеличения числа ГСК. Доказано, что взаимодействуя с клетками глиомы С6 в опухолевом очаге in vivo гемопоэтические стволовые клетки регулируют ключевые жизненные функции неопластических клеток. Стратегическим направлением дифференцировки ГСК в очаге является трансформация  микроглииоциты.

Впервые, с использованием постгеномных технологий изучены механизмы генерации новых субпопуляций мезенхимального субтипа ОСК, наиболее резистентных к облучению и химиотерапии. Предложено новое противоопухолевое вещество, эффективность которого in vitro превосходит темозоламид. Доказано, что выраженность противоопухолевого эффекта фаскаплизина зависит от времени экспозиции и дозы вещества. Доказано, что в концентрации 0,005 мкмоль/л фаскаплизин оказывает цитостатическое действие, которое c увеличением времени сменяется цитотоксическим. Установлено, что основным механизмом гибели клеток глиомы  является апоптоз. Обработка ГСК фаскаплизином позволяет получить культуру клеток с индуцированным апоптозом. Доказано, что трансплантация ГСК после комплекса стандартной терапии увеличивает выживаемость крыс с глиомой С6.  Применение стволовых клеток с индуцированным апоптозом  вызывает гибель опухолевых клеток, блокирует локальную трансмиссию TGF-1β в опухолевом очаге и повышает выживаемость экспериментальных животных.

3. Оценка соответствия полученных результатов техническим требованиям к выполненному проекту и перспектив продолжения работ по проекту

Полученные результаты соответствуют техническим требованиям, предъявляемым к результатам проекта. Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Таблица сравнения протеомных профилей клеточных линий нейрональных и мезенхимальных стволовых клеток и опухолевых стволовых клеток линии U87 глиобластомы человека (Протеомная карта)

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27.06.2014 года № 14.575.21.0038 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы» на этапе IV в период с 01.01.2016 по 31.06.2016 выполнялись следующие работы:

1. Разработка стратегии и единого алгоритма (метода) применения биомедицинского клеточного препарата в комплексной терапии глиобластомы у экспериментальных животных
2. Проведение сравнения показателей выживаемости  и функционального статуса групп животных с глиобластомой получавших стандартную химиотерапию; облучение и химиотерапию, биомедицинский препарат ГСК; облучение, химиотерапию и биомедицинский препарат ГСК.
3. Разработка предложений  по интеграции биомедицинского клеточного препарата в протоколы стандартизованного лечения опухолей мозга и путей коммерциализации результатов ПНИ
4. Выполнение работ по подбору оптимальных терапевтических агентов, доставляемых ГСК в опухолевый очаг и способных воздействовать на пути сигнальной трансдукции, ассоциированные с определенными белками в опухолевой стволовой клетке.
5. Разработка и обоснование стратегии и единого алгоритма (метода) применения биогмедицинского клеточного препарата ГСК при опухолях мозга, разработка предложений по его введению в протоколы стандартизованного лечения опухолей мозга и разработка путей коммерциализации результатов ПНИ.
6. Разработка проекта лабораторного регламента получения культур ГСК с противоопухолевыми свойствами
7. Разработка проекта лабораторного регламента производства биомедицинского клеточного препарата ГСК с ремоделированным протеомом и модифицированным сигналингом.
8. Выработка предложений и рекомендаций по внедрению разработанных методов на предприятиях специализирующихся на производстве клеточных препаратов
9. Выработка рекомендаций по использованию биомедицинского клеточного препарата ГСК в структуре комплексного и комбинированного лечения глиальных и метастатических опухолей головного мозга.
10. Наработка экспериментальных образцов биомедицинского клеточного препарата
11. Материально-техническое обеспечение ПНИ

При этом были получены следующие результаты

1) Краткое описание основных результатов:

Разработана стратегия и  алгоритм применения биомедицинского клеточного препарата (БМКП) в комплексной терапии глиобластомы у экспериментальных животных. За основную опорную точку принят объем опухоли менее 100 мм³, что является абсолютно необходимым условием исследования, позволяет обосновать  целесообразность применения биомедицинских клеточных препаратов (БМКП) ГСК с модифицированным протеомом, и показания к его применению. При наличии в мозге животного опухоли более 100 мм³, целесообразно перейти к комбинированной терапии с применением химиорадиотерапии, культур нативных ГСК и дендритных вакцин. Показано, что эффективность применения  БМКП в эксперименте сопоставима с ЛТ+ХТ терапией. В группе крыс с глиобластомой получавших комплексную терапию (ЛТ + ХТ + БМКП) отмечен минимальный объем опухоли (98,7±6 мм³),  а выживаемость составила 45,3± 5 сут, что достоверно (P< 0,05) больше контроля 28,2± 9,2 сут, а также  животных получивших только БМКП или  химиорадиотерапию.

Обязательным этапом лечения является создание биопаспорта опухоли и применение ХТ и ЛТ  в индивидуализированных на ИЛОК дозах, с обязательным протезированием нарушенных функций с использованием противоопухолевых вакцин. Обязательным этапам создания персонификации терапии ЗНО головного мозга является сравнительное протеомное картирование, профилирование и биоинформационный анализ ОСК/  НСК/ МСК. Первичной оптимальной дозой клеточного препарата для ЦРТ является 3 × 10⁵ клеток, которые применяются для воздействия на ВПСТ фокальной адгезии и TGF-1β в ОСК,  в сочетании с культурой ДВ, получаемой на основе МНК иммобилизуемых из системного кровотока, в количестве 15×10⁶.

Производных фаскаплизина 12, 13-Дигидро-9-йод- 13-оксопиридо[1,2-a:3,4-b′]]дииндол-5-иум бромид) и 3-Бром-12, 13-дигидро-13-оксопиридо[1,2-a:3,4-b′]] дииндол-5-иум бромид обладают высокой цитотоксической активностью в отношении клеток линии С6.  При этом 3-Бром-12, 13-дигидро-13-оксопиридо[1,2-a:3,4-b′]] дииндол-5-иум бромид характеризуется выраженным цитотоксическим действием в отношении CD 133+ клеток линии U87 глиобластомы, что позволяет считать это соединение оптимальным терапевтическим агентом, применимым для адресной доставки в неопластическую ткань и воздействия на ОСК. Разработанны клинические рекомендации и методы и алгоритмы применения БМКП в структуре лечения больных ЗНО головного мозга.

2) Оценка элементов новизны научных, конструкторских и технологических решений, информация о полученных за отчетный период охраноспособных РИД

Впервые разработана и обоснована стратегия и  алгоритм применения БМКП в терапии глиальных опухолей у экспериментальных животных, и показана перспективность этого метода как экспериментальной платформы для  создания новых способов лечения в нейроонкологии.  Впервые, на собственном экспериментальном материале  показана эффективность применения  БМКП в комбинированной (ЛТ+ХТ) и комплексной терапии глиом головного мозга. Разработаны принципы персонификации биотерапии опухолей и указанно на необходимость создание биопаспорта опухоли, целесообразности ведения индивидуальной линии опухолевых клеток. Обоснована необходимость  сравнительного протеомного картирования,  ОСК/  НСК/ МСК, и необходимость биоинформационного анализа протеомов, предложена методика такого анализа. Показана возможность создания культур ГСК воздействующего на данные типы мишеней и полученны образцы таких культур. Установлено впервые, что оптимальной дозой клеточного препарата для циторегуляторной терапии является 3 × 10⁵(десять в пятой) клеток, которые применяются для воздействия на ВПСТ фокальной адгезии и TGF-1β в ОСК,  в сочетании с дендритными вакцинами, получаемыми на основе мнононуклеарных клеток, иммобилизуемых из системного кровотока, в количестве 15×10⁶(десять в шестой). Предложены новые противоопухолевые агенты для доставки в опухолевый очаг, производных фаскаплизина 12, 13-Дигидро-9-йод- 13-оксопиридо[1,2-a:3,4-b′]]дииндол-5-иум бромид) и 3-Бром-12, 13-дигидро-13-оксопиридо[1,2-a:3,4-b′]] дииндол-5-иум бромид. Данные вещества обладают высокой цитотоксической активностью в отношении клеток глиальных опухолей, при этом 3-Бром-12, 13-дигидро-13-оксопиридо[1,2-a:3,4-b′]] дииндол-5-иум бромид характеризуется выраженным цитотоксическим действием в отношении CD 133+ клеток линии U87 глиобластомы, что позволяет считать это соединение оптимальным терапевтическим агентом, применимым для адресной доставки в неопластическую ткань и воздействия на ОСК. Разработаны клинические рекомендации и методы и алгоритмы применения БМКП в структуре лечения больных ЗНО головного мозга.

3) Оценка соответствия полученных результатов техническим требованиям к выполненному проекту и перспектив продолжения работ по проекту

Полученные результаты соответствуют техническим требованиям, предъявляемым к результатам проекта. Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.