Исследование молекулярных механизмов биотрансформации углеродных нано- и микрочастиц на примере гидробионтов Японского моря
Название проекта:
Исследование молекулярных механизмов биотрансформации углеродных нано- и микрочастиц на примере гидробионтов Японского моря
Номер соглашения:
21-74-00023
Руководитель проекта:
Пикула Константин Сергеевич
Сроки выполнения:
29.07.2020-30.06.2023
Основные полученные результаты:
Была проведена оценка воздействия углеродных наночастиц и частиц угольной пыли с использованием морских гидробионтов Японского моря: микроводорослей Attheya ussuriensis (Bacillariophyceae), Heterosigma akashiwo (Raphidophyceae), Porphyridium purpureum (Rhodophyceae), морских моллюсков Crenomytilus grayanus, Modiolus modiolus, Arca boucardi, и морских ежей Strongylocentrotus intermedius. Был оценен уровень токсичности и механизмы токсического действия углеродных нанотрубок и углеродных нановолокон с использованием трех видов микроводорослей, трех видов морских моллюсков и морских ежей. Проведены испытания углеродных нанотрубок (УНТ), фуллерена (C60), графена (Gr) и оксида графена (GrO) для оценки возможности и уровня биотрансформации в водной среде, а также при непосредственном контакте с клетками двух видов микроводорослей. Были показаны прямые зависимости между свойствами поверхности частиц и свойствами поверхности клеток испытываемых организмов. Более гидрофобные углеродные нановолокна с менее упорядоченной структурой оказывали большее влияние на красную микроводоросль P. purpureum, в сравнении с двумя другими использованными видами микроводорослей, из-за большей адгезии между частицами и слизистым покрытием клеток красной водоросли. Результаты исследования на гемоцитах морских моллюсков показали, показали обратный эффект, так более гидрофильные углеродные нанотрубки вызывали более сильные механические повреждения клеток гемоцитов по сравнению с гидрофобными и менее упорядоченными углеродными нановолокнами. Проведенные испытания по оценке биодеградации углеродных наночастиц можно разделить на три части: 1) оценка ингибирования роста микроводорослей Heterosigma akashiwo и Porphiridium purpureum, 2) оценка клеточных биохимических ответов микроводорослей и 3) оценка биотрансформации наноматериалов методами инфракрасной спектроскопии с преобразователем Фурье и рамановской спектроскопии. Клетки микроводорослей подвергали воздействию углеродных наночастиц в течение 7 дней с промежуточными измерениями через 3, 24 и 96 часов. С помощью проточной цитометрии оценивали ингибирования скорости роста, активности эстеразы, изменения мембранного потенциала и образования активных форм кислорода для каждого тестируемого вида наночастиц и на двух видах микроводорослей. На основании полученных результатов были определены максимальный уровень отсутствия наблюдаемого токсического эффекта (для всех показателей) и рассчитаны концентрации EC10 и EC50 для ингибирования скорости роста клеток. Рассчитанный уровень токсичности наночастиц (EC50 в мг/л, 96 ч) использованных в эксперименте для H. akashiwo снижался в следующем порядке: УНТ (18,98) > GrO (76,77) > Gr (159,40) > C60 (414,0). Для P. purpureum наблюдалась такая же зависимость но с более высокой чувствительностью: УНТ (2,08) > GrO (23,37) > Gr (94,88) > C60 (131,0). Также показана сильная деполяризация мембран в клетках микроводорослей под воздействием образцов с наибольшей наблюдаемой токсичностью, а именно УНТ и GrO. Более того, токсичность УНТ и GrO сочеталась с повышенным образованием АФК в клетках микроводорослей. Данный эффект может быть связан незначительным наличием примесей токсичных металлов, оставшимися после каталитического производства частиц. Предполагается, что основными причинами токсичности углеродных наноматериалов для микроводорослей являются механические повреждения, окислительный стресс и эффект затенения. В этом исследовании мы можем сделать вывод, что эффект затенения не оказал сильного влияния на рост микроводорослей из-за агломерации и осаждения частиц, а также того факта, что H. akashiwo является подвижным и в основном обитающим на поверхности видом. Следовательно, клетки H. akashiwo не были подвержены длительному механическому воздействию наночастиц при их быстром слипании и осаждении. Приведенные выше рассуждения также исключают длительное затеняющее действие осажденных наночастиц, что является критичным для фотосинтезирующих организмов. Следовательно, только образцы, вызывающие окислительный стресс, оказывали значительное явное токсическое воздействие на клетки H. akashiwo. В то же время клетки P. purpureum интенсивно слипались с наночастицами за счет более гидрофобной поверхности клеток, вызванной наличием слизистой полисахаридной оболочки. В этом случае механическое повреждение клеток играло заметно более выраженную роль, что и проявилось в более высокой чувствительности клеток P. purpureum к углеродным наночастицам. Таким образом P. purpureum является интересным объектом для дальнейшего изучения биотрансформации углеродных наночастиц при условии адаптации клеток микроводорослей к токсическому воздействию, что требует проведения отдельного цикла испытаний. Результаты оценки биотрансформации частиц показали, что наиболее устойчивым к биотрансформации из оцененных материалов был GrO, который не показал изменений в ИК и Рамановских спектрах после инкубации с микроводорослями. ИК спектры показали включение в структуру УНТ включений СН2 и СН3, а рамановская спектроскопия не выявила никаких структурных дефектов. Образец С60 кроме включений СН2 и СН3 подвергся окислению и приобретал более неупорядоченную структуру с наличием дефектов. Образец Gr показал включение амидной группы и наличие неупорядоченных участков в структуре графеновых листов. По результатам изучения биотрансформации углеродных наночастиц следует заключить, что структурные нарушения усиливались только в образцах с наименьшей токсичностью (С60 и Gr). Полученный результат показывает не только меньшую устойчивость данных образцов, но и большую возможность контакта морских организмов с такими частицами. Контакт микроводорослей с этими типами наночастиц был менее опасен для клеток микроводорослей, что обеспечивало большее количество взаимодействий клеток с углеродными частицами. Кроме того, было показано, что все протестированные частицы намного интенсивнее слипались в морской воде по сравнению с аналогичным экспериментом в дистиллированной воде, а образец фуллерена сохранял коллоидную устойчивость в дистиллированной воде вплоть до 7 дней. На основе данных рамановской спектроскопии существенных изменений в структуре частиц после экспозиции в морской воде по сравнению с дистиллятом не обнаружено. Однако, за счет большей коллоидной устойчивости в пресной воде, такие частицы могут представлять намного большую опасность для пресноводных организмов. Что требует дополнительного внимания и интерес представляет сравнение биотрансформации углеродных наночастиц при контакте с морскими и пресноводными организмами.
Научная и практическая значимость:
Результаты данного исследования дают представление о формировании принципов безопасного проектирования, производства и использования наночастиц с точки зрения их воздействия на морские экосистемы. Были установлены механизмы и уровни токсического действия (зависимость эффектов от концентрации) различных типов углеродных наночастиц для разных видов морских микроводорослей, моллюсков и морских ежей. Полученные данные и методика оценки трансформации углеродных наночастиц в водной среде и при контакте с морскими организмами могут быть использованы при планировании дальнейших испытаний, включая подбор условий и тест-объектов исследования.
Список основных публикаций:
Пикула К.С., Джохари С.А., Голохваст К.С. (Konstantin Pikula, Seyed Ali Johari, Kirill Golokhvast) Colloidal Behavior and Biodegradation of Engineered Carbon-Based Nanomaterials in Aquatic Environment Nanomaterials Nanomaterials 2022, 12, 4149. https://doi.org/10.3390/nano12234149 https://doi.org/10.3390/nano12234149 (2022 г.)