Использование подхода OSMAC (один штамм – много соединений) для поиска перспективных «молекул-лидеров» из морских микроскопических грибов Penicillium thomii

Название проекта:

Использование подхода OSMAC (один штамм – много соединений) для поиска перспективных «молекул-лидеров» из морских микроскопических грибов Penicillium thomii

Номер соглашения:

22-73-00190

Руководитель проекта:

Лещенко Елена Владимировна

Сроки выполнения:

27.07.2022-30.06.2024

Основные полученные результаты: 

Проведен скрининг для восьми штаммов морских микроскопических грибов рода Penicillium из Коллекции Морских Микроорганизмов (КММ) ТИБОХДВО РАН. Получено 165 экстрактов восьми штаммов грибов, культивированных согласно стратегии OSMAC (один штамм – много соединений). Для экстрактов пяти штаммов построены графики, отражающие площади пиков неполярной, средне-полярной и полярной области для каждого образца. Для экстрактов двух штаммов построены графики схожести грибных экстрактов, построенные методом главных компонент с кластеризацией k-средних. Исследовано 29 экстрактов методом ВЭЖХ-МС, в результате составлены таблицы, отражающие время выхода веществ и интенсивность пиков их молекулярных ионов. Для пяти экстрактов P. velutinum построена тепловая карта, отражающая содержание метаболитов в экстрактах. Показано существенное влияние условий культивирования на метаболизм микроскопических грибов. Исследовано 73 экстракта на активность в отношении S. aureus, E. coli и C. albicans. В отношении исследуемых бактерий активность показало 17 экстрактов. В отношении C. albicans активность проявило 52 экстракта. Для экстрактов, отобранных для масштабированного культивирования: P. thomii KMM 4679 (MgCl2*6H2O), показано ингибирование роста C. albicans (36.62 ± 1.04), ингибирование роста S. aureus (19.48 ± 1.47). Экстракт P. velutinum (Fe(NO3)3*9H2O) ингибировал рост только C. albicans (41.5 ± 0.6). Исследовано цитотоксическое действие 18 экстрактов в отношении опухолевой клеточной линии рака простаты человека PC-3 и нормальных клеток почки эмбрионов человека HEK-293T. Большинство экстрактов снижало жизнеспособность клеток РС-3 и НЕК-293 на 35-45%. Экстракт P. velutinum (10 г/л морской соли) снизил жизнеспособность раковых клеток PC-3 на 55%, в то время как жизнеспособность нормальных клеток HEK-293 снизилась на 85%. Экстракт P. velutinum (Fe(NO3)3*9H2O) неожиданно показал минимальную цитотоксичность в отношении обеих клеточных линий. В то время как другие экстракты, культивированные с металлами, проявляли цитотоксическое действие на клеточные линии PC-3 и HEK-293, сходное с контрольным экстрактом. Все экстракты P. thomii КММ 4679 оказались слаботоксичны как к нормальным, так и к опухолевым клеткам. Наименее токсичным к НEK 298 оказался экстракт P. thomii КММ 4679 (MgCl2*6H2O), при этом проявляя цитотоксичность в отношении РС-3 на 12.2%. Самым токсичным в отношении НEK 298 оказался экстракт P. thomii КММ 4679 (Ni(NO3)3*6H2O), уменьшая жизнеспособность этих клеток на 27.9 %, при этом жизнеспособность PC-3 под воздействием этого экстракта была уменьшена на 15%. В то время как контрольный экстракт уменьшал жизнеспособность нормальных клеток на 24.4%, а опухолевых на 8.9% Экстракты культур грибов, полученных с добавлением 10 г/л морской соли и ZnCl2 оказались наименее токсичными в отношении всех типов клеток. Цитотоксичность экстрактов, полученных с добавлением 20 и 30 г/л морской соли, а также Fe(NO3)3*9H2O была от 12.5% до 15% в отношении PC-3 и HEK-293. Проведено масштабированное культивирование грибов P. velutinum с добавлением Fe(NO3)3*9H2O и P. thomii КММ 4679 на стандартной среде и с добавлением MgCl2*6H2O, и морской соли (20 г/л). Два новых пиперазиновых производных хелвамиды B и С, совместно с двумя известными метаболитами, тиодикетопиперазином сароклазином A и сесквитерпеном гваяанового типа выделены из гриба P. velutinum. Структуры соединений установлены при помощи комбинации методов одно- и двумерной ЯМР-спектроскопии и массспектрометрии высокого разрешения. Для хелвамида B получены данные рентгеноструктурного анализа. Абсолютная конфигурация этого соединения определена при помощи квантово-химических расчетов (TDDFT). Сравнение спектров ЭКД, рассчитанных для R,R- и S,S- стереоизомеров, с экспериментальным спектром ЭКД соединения позволило достоверно установить конфигурацию хелвамида B как R,R. Квантово-химические расчеты позволили определить хелвамид С как смесь стереоизомеров (R,R и S,S). Хелвамид B снижал жизнеспособность PC3 на 34,03%, в то время как жизнеспособность HEK-293 снижалась только на 16,64%. Хелвамид C снижал жизнеспособность клеток PC3 на 39,41% и HEK293 на 28,42%. Хелвамид С подавлял рост C. albicans на 31,54%. Дрожжеподобный гриб C. albicans, вызывающий внутрибольничную инфекцию, значительно осложняет лечение других заболеваний и восстановление после хирургических вмешательств. Данные о новых противокандидозных соединениях, обладающих низкой токсичностью для клеток человека, являются многообещающими. 14 вторичных метаболитов, десять из которых оказались новыми представителями поликетидов декалинового типа, девять из которых были отнесены к типу зостеропениллинов: 11-α-зостеропениллин M, 8-гидрокси-11-βзостеропениллин M, зостеропениллины N-S, 8-гидрокси-зостеропениллин G, и одно производным паллидопениллина А: 13-дегидрокси-паллидопениллин A выделены из экстракта гриба P. thomii КММ 4679. Помимо новых метаболитов, было выделено четыре известных: зостеропениллины J и G, а также паллидопениллин А и его производное 1-ацетилпаллидопениллин А. Структуры соединений установлены методами одно и двумерной ЯМР-спектроскопии и массспектрометрии высокого разрешения. Относительные конфигурации соединении установлены на основании ROESY данных и значений КССВ. Абсолютные конфигурации зостеропениллина Q установлены как 4R,5S,8S,9R,10R,13R при помощи модифированного метода Мошера. Для установления абсолютных конфигураций новых 11-αзостеропениллина М (4R,5S,8S,10S,11S) и зостеропениллина N (4R,5S,8S,10S,11R) примен метод квантово-химических расчетов. 1-ацетил-паллидопениллин А проявляет цитотоксическую активность в отношении клеток PC-3 (ИК50 94,20 ± 1,13), ингибирует образование колоний этих клеток на более чем 50% в нетоксичной концентрации (2,5 мкМ) и подавляет их пролиферацию, но при этом не оказывает влияния на миграцию этих клеток. При совместном использовании 1-ацетил-паллидопениллина А (20 мкМ) и коммерческого препарата доксорубицина (10 мкМ) цитотоксическое действие на PC-3 существенно увеличивается. 8-гидрокси-11-β-зостеропениллин M (ИК50 = 87.29 ± 6.32), зостеропениллин О (ИК50 = 82.49 ± 6.51) и зостеропениллин G (79.68 ± 0.30) снижали жизнеспособность опухолевых клеток шейки матки Hela до 44.12 ± 5.13 – 34.35 ± 1.90%. 8-гидрокси-11-β-зостеропениллин M и 1-ацетилпаллидопениллин А (ИК50 = 71.98 ± 2.48) снижали жизнеспособность опухолевых клеток молочной железы человека MCF-7 до 57.46 и 23.71% соответственно. 11-α-зостеропениллин M, зостеропениллин О, зостеропениллин R и зостеропенилиин S в концентрациях 10-20 мкМ оказывали цитопротективное действие на клетки HEK-293 в модели гипоксии, вызванной хлоридом кобальта (II), увеличивая жизнеспособность клеток на 30-50% и снижая уровень перекисного окисления липидов в митохондриях. 11-α-зостеропениллин M, зостеропениллин P, зостеропениллин Q и 1-ацетил-паллидопениллин А (100 мкМ) ингибировали рост S. aureus на 28.99-31.65%. Зостеропениллин О ингибировал рост C. albicans на 35.31% при 100 мкМ. Таким образом, гриб P. thomii КММ 4679 является продуцентом биоактивных поликетидов декалинового типа. Данные поликетиды можно отнести к типу ловастатина, однако, зостеропенилины и паллидопенилины не имеют метильной группы при С-4 и впервые были выделены и опубликованы из грибов P. thomii Коллекции Морских Микроорганизмов (КММ) ТИБОХДВО РАН и более не выделялись из микроорганизмов других коллекций. Подробное изучение путей биосинтеза и активных биосинтетических кластеров в различных условиях культивирования позволит контролируемо продуцировать наиболее активные метаболиты. Штамм P. velutinum из КММ ТИБОХДВО РАН, способен продуцировать алкалоиды в достаточных количествах при наличии достаточного количества источников азота в питательной среде (количество азота в питательной среде можно регулировать согласно стратегии OSMAC). Грибы P. antacrticum из КММ ТИБОХДВО РАН, в том числе ранее не исследованные, являются продуцентами меротерпеноидов цитреогибриддионового типа - ингибиторов p-гликопротеина. Результаты скрининга грибов рода Penicillium из КММ ТИБОХДВО РАН, полученные в ходе работы, будут основой для дальнейших работ по поиску перспективных продуцентов биоактивных вторичных метаболитов. Для метаболитов (8- гидрокси-11-β-зостеропениллина M, зостеропениллина О и зостеропениллина G) проявивших цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток шейки матки Hela и 1-ацетил-паллидопениллин А проявившего цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток молочной железы человека MCF-7 будут проведены дополнительные исследования их противоопухолевых свойств.

Научная и практическая значимость:

Среди морских микроскопических грибов рода Penicillium был обнаружен еще один высокопродуктивный источник (Penicillum thomii KMM 4679, морская трава Zostera marina) поликетидов декалинового типа относящихся к серии зостеропениллинов и паллидопениллинов. Данная серия ранее выделялась только из грибов P. thomii хранящихся в Коллекции Морских Микроорганизмов ТИБОХДВО РАН и имеет характерные структурные особенности, а именно отсутствие метильной группы при С-4 (в отличии от ловастанового кора). В результате удалось выделить десять новых представителей этой серии, включая хлорсодержащее производное, а также четыре известных соединения. Полученные результаты позволили предположить биосинтетические этапы продукции этих соединений. Нами было показано, что 1-ацетил-паллидопениллин А проявляет цитотоксическую активность в отношении клеток рака простаты человека PC-3 (ИК50 94,20 ± 1,13), ингибирует образование колоний этих клеток на более чем 50% в нетоксичной концентрации (2,5 мкМ) и подавляет их пролиферацию, но при этом не оказывает влияния на миграцию этих клеток. При совместном использовании 1-ацетил-паллидопениллина А (20 мкМ) и коммерческого препарата доксорубицина (10 мкМ) цитотоксическое действие на клетки рака простаты человека PC-3 существенно увеличивается. 8-гидрокси-11-βзостеропениллин M (ИК50 = 87.29 ± 6.32 мкМ), зостеропениллин О (ИК50 = 82.49 ± 6.51 мкМ) и зостеропениллин G (79.68 ± 0.30) снижали жизнеспособность гормон-зависимых клеток рака шейки матки Hela до 44.12 ± 5.13 – 34.35 ± 1.90%. 8-гидрокси-11-β-зостеропениллин M и 1-ацетил-паллидопениллин А (ИК50 = 71.98 ± 2.48 мкМ) снижали жизнеспособность клеток гормон-зависимых клеток рака молочной железы человека MCF-7 до 57.46 и 23.71% соответственно. Новые соединения 11-α-зостеропениллин M, зостеропениллин О, зостеропениллин R и зостеропенилиин S в концентрациях 10-20 мкМ оказывали цитопротективное действие на клетки эмбриональной почки человека HEK-293 в модели гипоксии, вызванной хлоридом кобальта (II), увеличивая жизнеспособность клеток на 30- 50% и снижая уровень перекисного окисления липидов в митохондриях. 11-α-зостеропениллин M, зостеропениллин P, зостеропениллин Q и 1-ацетил-паллидопениллин А (100 мкМ) ингибировали рост S. aureus на 30.08, 28.99, 29.95 и 31.65% соответственно. Зостеропениллин О ингибировал рост C. albicans на 35.31% при 100 мкМ. Таким образом, гриб P. thomii КММ 4679 (морская трава Zostera marina) является продуцентом биоактивных поликетидов декалинового типа. Подробное изучение путей биосинтеза и активных биосинтетических кластеров в различных условиях культивирования позволит контролируемо продуцировать наиболее активные метаболиты. Благодаря использованию математических подходов для анализа ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-МС хроматограмм экстрактов микроскопических грибов, было показано существенное влияние условий культивирования на метаболизм микроскопических грибов. Изменение условий культивирования согласно стратегии OSMAC позволяет влиять на метаболизм микроскопических грибов. Штамм P. velutinum из КММ ТИБОХДВО РАН, способен продуцировать алкалоиды в достаточных количествах при наличии достаточного количества источников азота в питательной среде (количество азота в питательной среде можно регулировать согласно стратегии OSMAC). Грибы P. antacrticum из КММ ТИБОХДВО РАН, в том числе ранее не исследованные, являются продуцентами меротерпеноидов цитреогибриддионового типа - ингибиторов p-гликопротеина.

Список основных публикаций:

1. Боркунов Г.В., Лещенко Е.В., Бердышев Д.В., Попов Р.С., Чингизова Е.А., Шлык Н.П., Герасименко A.В., Киричук Н.Н., Худякова Ю.В., Чаусова В.Е., Антонов А.С., Калиновский A.И., Чингизов A.Р., Юрченко E.A., Исаева M.П., Юрченко A.Н. (Borkunov G.V., Leshchenko E.V., Berdyshev D.V., Popov R.S., Chingizova E.A., Shlyk N.P., Gerasimenko A.V., Kirichuk N.N., Khudyakova Y.V., Chausova V.E., Antonov A.S., Kalinovsky A.I., Chingizov A.R., Yurchenko E.A., Isaeva M.P., Yurchenko A.N.) New Piperazine Derivatives Helvamides B–C from the Marine-Derived Fungus Penicillium velutinum ZK-14 Uncovered by OSMAC (One Strain Many Compounds) Strategy Springer https://doi.org/10.1007/s13659-024-00449-9 (2024 г.)

2. Лещенко Е.В., Боркунов Г.В., Шлык Н.П., Худякова Ю.В., Попов Р.С. (Leshchenko E.V., Borkynov G.V., Shlyk N.P., Khudyakova Y.V., Popov R.S.) Использование подхода OSMAC с целью поиска новых вторичных метаболитов морских микроскопических грибов XX Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии 2023, с. 51 https://doi.org/10.47471/20_2023_09_04_08_0.- (2023 г.)

3. Лещенко Е.В. (Leshchenko E.V.) Метаболиты морских грибов, ассоциированных с водорослями и травами, и перспективы их дальнейшего изучения при помощи стратегии OSMAC ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ В ИССЛЕДОВАНИЯХ ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ. ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНАЯ ШКОЛАКОНФЕРЕНЦИЯ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ И СТУДЕНТОВ 2023, с. 111 https://doi.org/10.24866/7444-5579-8 (2023 г.)

4. Боркунов Г.В., Чингизова Е.А., Лещенко Е.В. (Borkunov G.V., Chingizova E.A., Leshchenko E.V.) Подбор условий культивирования микроскопического морского гриба Penicillium velutinum KMM 4674 с помощью стратегии OSMAC Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: материалы XIII Международной научной конференции 2023. 466 с. (2023 г.)