Исследование таксономического разнообразия и нефтеуглеводородокисляющего потенциала бактерий Японского моря
Название проекта:
Исследование таксономического разнообразия и нефтеуглеводородокисляющего потенциала бактерий Японского моря
Номер соглашения:
19-74-00028
Руководитель проекта:
Богатыренко Елена Александровна
Сроки выполнения:
09.08.2019-30.06.2021
Основные полученные результаты:
Материалом для работы послужили пробы поверхностных вод и донных осадков Японского моря, полученных в 2018 и 2019 годах в ходе экспедиционных работ ФГБУН «Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева» ДВО РАН и Дальневосточного федерального университета на НИС «Академик М.А. Лаврентьев» (рейсы № 81 и № 88), а также в ходе береговых экспедиций. Исследования проводились на 50 станциях в трех районах: в северной части Японского моря (между 43°25' и 44°36' с.ш. и между 136°32' и 137°51' в.д.), в заливе Петра Великого (между 42°16' и 43°09' с.ш. и между 130°56' и 133°02' в.д.), в западной части Японского моря (между 36°42' и 42°13' с.ш. и между 130°12' и 131°13' в.д.). Выделение бактерий, способных к биодеградации углеводородов, проводили по известной методике (Патент РФ № 2520084) при температурах 5°С и 22°С. Чистые культуры идентифицировали на основе анализа их гена 16S рРНК. Полученные в ходе работы нуклеотидные последовательности были внесены в базу данных GenBank NCBI. В ходе исследования 50 станций в Японском море с 42 из них были выделены и идентифицированы 142 штамма углеводородокисляющих бактерий. Изучение таксономического положения полученных культур показало, что они относятся к бактериям типов Actinobacteria, Firmicutes и Proteobacteria. Подавляющее большинство нашей коллекции относилось к группе наиболее распространенных в водной и почвенной среде нефтеокисляющих микроорганизмов. Однако, нам также удалось выделить 12 штаммов тех видов бактерий, для которых углеводородокисляющая активность обнаружена впервые в рамках данной работы. К ним относились 5 видов типа Firmicutes (Gracilibacillus massiliensis, Thalassobacillus sp., Virgibacillus dokdonensis, Chryseomicrobium amylolyticum и Jeotgalibacillus marinus), 4 вида бактерий типа Actinobacteria (Okibacterium sp., Lechevalieria flava, Patulibacter sp. и Patulibacter minatonensis) и 3 вида типа Proteobacteria (Moraxella osloensis, Idiomarina maritima и Idiomarina piscisalsi). На следующем этапе работы была изучена способность всех выделенных штаммов расти на средах с нефтью и нефтепродуктами при температурах 22°С и 5°С. Результаты работы показали, что при 22°С на средах с представленными субстратами росли все штаммы исследуемых бактерий. При температуре 5°С на средах с дизелем и мазутом росли 22 штамма бактерий, а на среде с нефтью - только 17 штаммов. Для количественной оценки углеводородокисляющей активности методом хромато-масс-спектрометрии были взяты 30 штаммов бактерий. Модельная смесь углеводородов была приготовлена на основе коммерчески доступного летнего дизельного топлива с добавлением химически чистого нафталина, антрацена и фенантрена. Анализ метаболической активности бактерий проводили на хромато-масс-спектрометре Shimadzu GCMS 2010 Ultra на 1, 3, 5, 7, 14, 21 и 28 сут для образцов, которые инкубировали при 22°С, и на 1, 7, 14, 28, 42, 56, 70 и 90 сут для образцов с психтрофами. Степень утилизации бактериями углеводородов выражали в процентах и оценивали по изменению концентрации компонентов модельной смеси углеводородов в процессе инкубации по отношению к исходным значениям. Установлено, что для исследуемых штаммов степень окисления всех углеводородов при температуре 22°С к окончанию эксперимента (28 сут) варьировала в пределах 49-88%. При температуре 5°С почти все психротрофные штаммы окислили большую часть исследуемых углеводородов к 28 сут наблюдения. На 90 сут эксперимента не было зафиксировано существенной разницы в степени утилизации углеводородов по сравнению с данными, полученными на 28 сут. К окончанию эксперимента убыль отдельных алканов составила 43-100%, а убыль ПАУ – 67-91%. Все исследуемые мезофильные и психротрофные бактерии проявили высокую окислительную способность в отношении разложения н-алканов (С9-С27), фитана, пристана и полициклических ароматических углеводородов. Однако, в первую очередь из алканов разложению подвергались углеводородов с длиной углеродной цепи 9-14 и 21-27 атомов. Из ПАУ лучше всего микроорганизмы разлагали нафталин и антрацен. Со всей коллекцией штаммов углеводородокисляющих бактерий, полученных из донных осадков и поверхностных вод Японского моря, была проведена работа по выявлению у них генов группы алкан-гидроксилаз (alk1, alk2, alk3, Rh alkB1), генов окисления нафталина (nahAc, nah, narAb, narAa, nagG, nahH, nahAc7), фенантрена (phn, pdo), катехола (xylE, C23O) и бифенила (bphA1). Установлено, что среди генов, регулирующих окисление алканов, чаще всего у бактерий встречался alk1 (72%), гораздо реже alk3 (38%). Ген alk2 был обнаружен только у бактерий, выделенных из глубоководных осадков северной части Японского моря, а ген Rh alkB1 - только у некоторых родококков, независимо от района получения изолятов. Из генов, ответственных за окисление полициклических ароматических углеводородов, у полученных нами бактерий чаще всего выявляли xylE (81%), кодирующий синтез диоксигеназы мета-расщепления катехола, одного из ключевых соединений метаболического пути окисления ПАУ. Остальные гены, ответственные за деградацию ПАУ, встречались гораздо реже (до 45%). Проведенный анализ показал, что у наиболее активных штаммов, разлагающих нефтяные углеводороды при 22°С (Pseudomonas sp. AE_8H, Acinetobacter sp. VL_204-3W) было обнаружено по 6-7 генов деструкции алканов и ПАУ. В то же время у самого активного психротрофного штамма Rhodococcus erythropolis AP_291 было выявлено всего 2 гена (Rh alkB1 и xylE). Подобные результаты не позволяют сделать однозначного вывода о связи количества выявленных функциональных генов с метаболической активностью бактерий, а также указывают на необходимость более детального изучения процесса окисления углеводорода в условиях низких температур. Кроме того, вероятно, дополнительно требуется изучение экспрессии соответствующих генов. Таким образом, из полученной нами коллекции углеводородокисляющих микроорганизмов наиболее перспективными для биоремедиации акваторий Японского моря являются 7 штаммов мезофильных бактерий (Pseudomonas sp. AE_8H, Acinetobacter sp. VL_204-3W, Paenibacillus polymyxa AP_212128, Acinetobacter marinus AE_2, Cobetia marina AE_2-4W, Enterobacter sp. NH_8-3K и Rhodococcus sp. AP_21102) и 2 штамма психротрофных бактерий (Rhodococcus erythropolis AP_291 и Pseudomonas sp. AP_27). Для скрининговых исследований, направленных на поиск углеводородокисляющих бактерий в Японском море, может быть использован подход выявления у микроорганизмов генов alk1 и xylE, как наиболее часто встречающихся генов среди микробиоты данного региона. Информационные ресурсы в сети Интернет, посвященные проекту: https://indicator.ru/earth-science/biologi-issleduyutkak-bakterii-yaponskogo-morya-spravlyayutsya-s-... https://www.dvfu.ru/science/the-r-d-results/current-projects-rscf/19-74-00028/
Научная и практическая значимость:
В ходе реализации настоящего проекта из Японского моря была получена обширная коллекция мезофильных и психротрофных штаммов углеводородокисляющих бактерий. Методами хромато-масс-спектрометрического и молекулярно-генетического анализа была доказана их высокая эффективность в разложении различных нефтяных углеводородов. На основе наиболее активных штаммов бактерий могут быть созданы коммерческие препараты для ликвидации аварийных разливов нефти и нефтепродуктов в дальневосточных морях. Кроме того, для скрининговых исследований, направленных на поиск углеводородокисляющих бактерий в Японском море, может быть использован подход выявления у микроорганизмов генов alk1 и xylE, как наиболее часто встречающихся генов среди микробиоты данного региона.
Список основных публикаций:
1. Дункай Т.И., Богатыренко Е.А., Ким А.В., Дашков Д.В. (Dunkai T.I., Bogatyrenko E.A., Kim A.V., Dashkov D.V.) Нефтеокисляющий потенциал бактерий поверхностных вод Японского моря Сборник избранных статей по материалам Международной научной конференции "Технические и естественные науки". Издательство: Гуманитарный национальный исследовательский институт «НАЦРАЗВИТИЕ» (Санкт-Петербург) с. 11-12 https://doi.org/10.37539/TNS293.2020.16.37.001 (2020 г.)
2. Богатыренко Е.А., Ким А.В., Дункай Т.И., Пономарева А.Л., Еськова А.И., Сидоренко М.Л., Окулов А.К. (Bogatyrenko E.A., Kim A.V., Dunkai T.I., Ponomareva A.L., Es'kova A.I., Sidorenko M.L., Okulov A.K.) Таксономическое разнообразие культивируемых углеводородокисляющих бактерий в Японском море Биология моря Т. 47, № 3, С. 1-9 https://doi.org/10.31857/S0134347521030037 (2021 г.)
Результаты интеллектуальной деятельности:
1. Авторы РИД: Богатыренко Е.А., Дункай Т.И., Ким А.В., Пономарева А.Л., Дашков Д.В. Вид РИД: База данных Название РИД: Таксономическое разнообразие культивируемых углеводородокисляющих бактерий Японского моря Дата заявки на регистрацию РИД / Реквизиты (номер патента или свидетельства о государственной регистрации) документа об охране исключительных прав (при наличии): 13.11.2020 / Свидетельство о государственной регистрации 2020622356 Перечень правообладателей: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Дальневосточный федеральный университет" (ДВФУ)